Основав в Южной Африке христианскую миссию, Ливингстон совершил труднейшее путешествие — с женой и детьми — через полупустыню Калахари. В то время считалось, что эта территория к северу, в зоне тропиков, переходит в непроходимую пустыню.
Ливингстон женился на дочери местного миссионера Мэри Моффет, ставшей ему верной спутницей в жизни и путешествиях. Он изучил язык племени бечуанов, среди которых жил, и это помогло ему без переводчиков общаться с племенами Южной и Центральной Африки, говорящими на языке группы банту, к которой относится и диалект бечуанов. Семь лет он совершал сравнительно небольшие маршруты. Его заинтересовали рассказы негров об озере Нгами — прекрасном и обширном. К этому озеру и направился он со всей семьей и двумя спутниками в 1849 году. Они пересекли с юга на север Калахари, добравшись до этого обширного мелководного и периодически пересыхающего озера. В следующем году он сумел пройти еще дальше на север, к долине Замбези, и организовал там базу, заручившись поддержкой местного вождя.
Оказалось, что за степями и пустынями Калахари находятся плодородные саванны, изобилующие дичью, а не выжженный солнцем край. Но природа оказалась более приветливой, чем отношения между английскими и голландскими переселенцами в Южную Африку. Вернувшись в свою духовную миссию, Ливингстон обнаружил, что она подверглась нападению голландцев-буров. Он переехал в Кейптаун, отправил свою семью в Англию, освоил основы геодезии и вновь отправился на Замбези в 1853 году. По ее главному истоку, Лиамбаю, он поднялся вверх по течению, прошел сушей в бассейн реки Конго, двинулся на запад, пересек невысокие возвышенности и достиг города Лоанду на побережье Атлантического океана.
После недолгого отдыха он отправился в обратный путь, вышел к долине Замбези и отправился вниз по течению. Ему посчастливилось первому из европейцев увидеть самый мощный в мире водопад (Виктория) шириной в 1800 м, где воды Замбези низвергаются со 120-метрового обрыва. Река, пересекающая горные гряды, оказалась бурной, порожистой, так что значительную часть пути приходилось идти по ее долине, а не сплавляться
«Господствовало убеждение, — писал он, — что значительная часть внутренней Африки представляет собой пустыню, куда текут и в песках которой теряются реки. Я же в ходе своего путешествия 1852—1856 гг. от океана до океана через южную тропическую часть континента обнаружил, что вся эта область на самом деле хорошо орошена, что в ней имеются большие территории с плодороднейшей, покрытой лесами почвой, а также прекрасные травянистые долины, в которых живет значительное население, и я обнаружил также один из замечательнейших водопадов в мире. Вслед за этим удалось выяснить особенности физического устройства Африки. Она оказалась возвышенным плато, несколько понижающимся в центре и с расщелинами по бокам, по которым реки сбегают к морю».
Его возвращение в Англию было триумфальным. Королева лично приветствовала его (памятуя, конечно, что он назвал великий водопад ее именем). Публика с упоением читала его прекрасно написанный отчет «Путешествия и исследования миссионера в Южной Африке». Но почивать на лаврах он не стал, отправившись в 1859 году в новую экспедицию. Его назначили консулом области Замбези. С ним поехало несколько помощников.
«Нашей целью, — писал Ливингстон, — было не открытие каких-либо баснословных чудес, а ознакомление с климатом, естественными богатствами, местными болезнями, туземцами и их отношением к остальному миру, что мы и делали с тем особенным интересом, какого не могут не испытывать, задумываясь о будущем, первые белые люди при работе на континенте, история которого только начинается». На этот раз он обследовал район левого притока Замбези, открыв огромное озеро Ньяса, вытянутое с юга на север. «По обеим сторонам озера возвышаются хижины, — отметил он, — но дым от горевшей травы ограничивал наше поле зрения».
Его жене Мэри суждено было умереть на Замбези от тропической лихорадки в апреле 1862 года. Ливингстон записал в своем дневнике: «Ночью сколотили гроб, на другой день под ветвями большого баобаба вырыли могилу, и маленькая группа сочувствующих соотечественников помогла убитому горем мужу похоронить покойницу».
Несмотря ни на что Ливингстон продолжал исследовать Центральную Африку в надежде обнаружить истоки Нила. После недолгого пребывания в Англии он в 1866 году вновь высадился в устье Занзибара, прошел вдоль побережья на север до реки Рувумы, повернул на запад, достиг озера Ньяса, обогнул его с юга, прошел до берегов Танганьики и пропал бесследно. На его поиски был направлен журналист и разведчик Генри Стэнли. От Занзибара он с группой вооруженных белых и без малого двумя сотнями носильщиков двинулся на запад. В ноябре 1871 года в поселке Уджиджи на берегу озера Танганьика он встретил Ливингстона, который очень ослабел от малярии. Несмотря на сильную слабость, Ливингстон вместе со Стэнли продолжил обследование берегов Танганьики, убедившись, что отсюда нет стока на север, к Нилу. Стэнли отправился в Европу, но Ливингстон остался, решив обязательно выяснить вопрос об истоках Нила. В мае 1873 года он умер. Его чернокожие спутники бережно сохранили все дневники и собранные материалы. Они торжественно предали африканской земле сердце путешественника и гуманиста, а тело забальзамировали и десять месяцев несли на носилках до берега Индийского океана, почти за полторы тысячи километров. Похоронили Ливингстона в лондонском Вестминстерском аббатстве — усыпальнице королей и выдающихся деятелей Англии.